比較轉錄組學揭示紅曲霉胞外多糖合成候選基因

        2022-08-18


        近日,南昌大學黃志兵教授課題組在《Food Research International》上發表了題目為“Comparative transcriptome analysis of Monascus purpureus at different fermentation times revealed candidate genes involved in exopolysaccharide biosynthesis”的研究性論文。

        摘要:胞外多糖(EPS)是藥用食用菌紅曲霉的代謝產物,具有抗氧化、免疫調節和抗炎作用。但其生物合成機理尚不清楚,阻礙了其開發利用。本研究對紫色紅曲的發酵條件進行了優化,并通過比較轉錄組學分析了EPS合成的機制和影響。最佳培養基組成為40g/L甘露糖,4g/L酵母粉,1 g/L MgSO4?7H2O, 0.8 g/L KH2PO4,1.6 g/L K2HPO4?3H2O, 2ml/L吐溫80,最佳培養條件為接種量7%,培養溫度30℃,初始pH 6.0, 180 rpm,培養4d。共獲得8095個unigenes,鑒定出17種EPS合成的關鍵酶。有趣的是,與發酵2天相比,發酵4天組有12個碳水化合物代謝亞類富集,大部分差異表達基因(DEGs)上調,但只有9個差異表達基因(DEGs)隨著發酵時間的延長而富集,所有差異表達基因(DEGs)均下調。本研究為提高EPS含量提供了理論基礎,揭示了EPS合成動態,為未來EPS分子修飾和基因敲除研究提供了重要靶點。


        研究內容


        1、培養基對EPS產生的影響

        圖1:紫色紅曲發酵培養基的優化。不同碳源對(A)EPS和菌絲多糖產量及(B)菌絲生物量濃度的影響。(C)糖濃度對EPS產量和菌絲生物量濃度的影響。不同氮源對(D)EPS和菌絲多糖產量及(E)菌絲生物量濃度的影響。酵母提取物濃度(F)、MgSO4?7H2O濃度(G)、KH2PO4和K2HPO4?3H2O濃度(H)和表面活性劑類型(I)對EPS產量和菌絲生物量濃度的影響。


        2、培養條件對EPS產量的影響


        表1: 不同培養條件對紅曲霉胞外多糖(EPS)及生物量的影響



        3、形態分析



        圖2:(A)在100×、2500×、10000 ×放大率下,從左到右排列的紫色紅曲掃描電鏡圖像。(B)不同發酵條件下菌絲體宏觀形態。


        4、紫色紅曲40269不同發酵時間的RNA-seq測序



        圖3:用RNA-Seq分析不同發酵時間紫色紅曲的基因表達譜。(A)樣本表達式分布圖。(B)紫色紅曲在EMP2、EMP4和EMP6階段的主成分分析(PCA)。(C)紫色紅曲三個生物重復序列轉錄組間相關性的Spearman相關系數(SCC)分析。


        5、unigenes的功能注釋


        圖4:紫色紅曲的所有unigenes的生物信息學分析。(A) 紫色紅曲的GO功能分類。(B)碳水化合物代謝途徑分類。(C) KEGG通路單基因分配。


        6、KEGG途徑分析參與EPS生物合成的功能基因



        圖5:紫色紅曲EPS的生物合成途徑?;罨膯翁菃挝伙@示為紅色。編碼該酶的每個單基因在每一步的表達水平被顯示為熱圖。列EMP2、EMP4、EMP6分別對應發酵時間的第2天、第4天、第6天。藍色和紅色分別代表低和高表達水平。非虛線箭頭表示酶促反應,虛線箭頭表示經過幾個步驟的幾個酶促反應。


        7、發酵過程中紫色紅曲40269的轉錄譜變化



        圖6:紫色紅曲發酵過程中DEGs的數量。(A)在EMP2、EMP4和EMP6處的共同和唯一的DEGs在加粗維恩圖中表示。(B)不同組的DEGs數量。



        圖7:DEGs的GO和KEGG富集分析。比較組中EMP2 vs EMP4 (A)、EMP4 vs EMP6 (B)、EMP2 vs EMP6 (C)前20個GO術語的分類和主要富集的顯著性圖。比較組中EMP2 vs EMP4 (D)、EMP4 vs EMP6 (E)、EMP2 vs EMP6 (F)前20個通路的顯著性氣泡圖。


        8、關鍵酶的驗證和分析



        圖8:(A) RNA-seq結果中影響EPS合成的關鍵酶(HK、MPI、UGDH、GALE、pgm、GPI和cat)的表達。(B)影響紫色紅曲不同發酵時期EPS合成的關鍵酶(HK、MPI、UGDH、GALE、pgm、GPI和cat)的活性。


        結論:


        最佳培養基組成為:40 g/L甘露糖,4 g/L酵母粉,1 g/L MgSO4?7H2O, 0.8 g/L KH2PO4, 1.6 g/L K2HPO4?3H2O, 2ml /L吐溫80,最佳培養條件(接種量為7%,培養溫度30℃,初始pH6.0, 180 r/min,培養4 d)。


        鑒定出參與EPS生物合成的17種關鍵酶(HK、PMM、MPI、GMPP、GPI、UGP2、pgm、AXS、abfA、GALE、E2.7.1.46、UGDH、UXE、USP、RHM、wbpP、aknA),并對其進行DEGs分析。


        酶聯免疫分析驗證了幾種關鍵酶,結果與RNA-seq分析結果一致。本研究闡明了EPS生物合成的可能機制,并對其合成途徑進行了表征,為未來EPS分子修飾和基因敲除研究提供了重要靶點。然而,未來的研究應該集中在調控EPS合成的關鍵候選基因的功能。



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